秦培鹏1,2，傅
力3
（1.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830052；
2.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；
3.韩山师范学院生物系，广东潮州 521041）
摘要：本文以猴头菌子实体为试料，在确定最优发酵培养基的基础上，进行不同温度、起始pH、装液量、接种量、摇床转速的单因素试验，结果表明，猴头菌摇瓶培养的最优条件为：25℃、起始pH值5.5、摇瓶装液量100ml/250ml、接种量7.5ml、摇床转速14Or/min。
关键词：猴头菌；深层发酵；摇瓶培养；优化
猴头菌(Hericiumer
erinaceus)营养价值非常高，味道鲜美，被誉为“四大山珍”[1]，因其含有较多蛋白质和多种糖类，对人体非常健康，具有较好的抗癌和增强机体免疫功能作用[2-4]。通过深层发酵获得的菌丝体与人工栽培所获得的子实体在具体效用上相差很小，通过这种方式，可以缓解人们对该菌的需求，但目前关于猴头菌深层发酵的相关研究开展较少，有关的研究报道结论还不完全一致[5- 8]。为了更好地开发利用猴头菌资源，我们对猴头菌的菌丝培养开展了系统的研究，希望能够对大规模制备其菌丝体及相关研究提供科学的、完整的依据。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
1）菌种：猴头菌（Hericiumer
erinaceus) 由辽宁省真菌研究所提供。
2）培养基：①马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200g、葡萄糖25g、琼脂20g、水1000mL（121℃灭菌20min）[9]。②液体种子培养基：酵母膏0.1%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、马铃薯20%、VB10.01%、pH6.5。③基础培养基：可溶性淀粉2.5%、酵母膏2.5%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、VB110mg/100mL、pH5.0[10]。
3）主要仪器、设备：SHST-YM50Z型座式自动电热压力蒸汽灭菌器、HY-5型回旋振荡器、PYX-250S-A 型生化培养箱、202-00A型电热恒温干燥箱、布氏漏斗和250mL 三角瓶、电子天平、洁净工作台。
1.2 实验方法
1）猴头菌的培养方法。①菌种活化：将事先购买的菌种无菌接种到斜面固体培养基上，在25℃条件下，培养至菌丝体覆盖斜面（3d左右）。②液体菌种培养：在无菌工作台内，将斜面菌种接入到液体培养基，放入25℃恒温摇床中，摇床转速设定为180r/min，培养24h待用。摇瓶的培养：按上述操作方法，用250ml三角瓶进行摇瓶培养，条件设定为培养基100ml，接种量10%，恒温摇床温度设定25℃，转速180r/min，摇床培养3d。
2）猴头菌液体发酵条件的优化。采用单因素对照实验法，分别确定好猴头菌液体发酵的最佳温度(℃)、pH、接种量（ml）、装液量（ml）、摇床转速（r／min）等参数[11]，具体实验设计（如表1）。
表1 猴头菌液体发酵条件单因素对照实验设计表
|
因素
水平
|
温度(℃)
|
pH
|
接种量（ml）
|
裝液量（ml）
|
转速（r／min）
|
|
1
2
3
4
5
6
|
21
23
25
27
29
※
|
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
|
5
7.5
10
12.5
15
※
|
60
80
100
120
140
※
|
100
120
140
160
180
200
|
注：※表示该水平未设计实验（使用lmol/L的HCl和lmol/L的NaOH对液体发酵培养基的pH进行调节）。
2 结果与分析
确定发酵培养基后，合适的培养环境能显著提高菌丝体产量，研究发现，猴头菌液体发酵的环境影响因子是多方面的，本实验针对其中的几个主要影响因子温度、pH、装液量、接种量、摇床转速等开展了相关研究，并在前期实验中总结前人相关研究基础，对上述实验因子有关设计参数做了借鉴，在此基础上确定猴头菌最适的液体深层发酵条件。
2.1 最佳培养温度的确定
由于微生物对温度敏感，它直接影响微生物的生长和相关产物的形成，是影响微生物生长速率的重要条件之一。适宜的发酵培养温度是保证本实验正常进行，延续后续研究的基础，本实验针对培养温度设定了21℃、23℃、25℃、27℃和29℃这5个梯度开展培养研究。
试验得出，猴头菌在实验设定的温度范围内均能生长，当温度设定较低时，菌丝体生长速率慢，产量较低，随着温度的增加，菌丝体产量呈依次上升趋势，在25℃、27℃、29℃分别测得菌丝体产量为12.23 mg/m1、12.48mg/m1、12.57 mg/m1。胞外多糖产量在实验设定的温度条件下，先升后降，在25℃时得出率最高，说明培养温度过低、过高会影响胞外多糖得率。通过综合考虑，本实验认为猴头菌液体发酵的合适的培养温度为25℃。
2.2 起始最佳培养pH的确定
发酵液pH的高低直接影响菌丝体生长，适宜的pH值有利于菌丝体快速生长繁殖，获得高的产量。本实验针对发酵液起始pH设定了4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0这6个梯度开展培养研究。
试验得出，发酵液起始pH=5.5时，菌丝体的生长最快，菌丝体产量为11.78mg/ml，而发酵液起始pH=6.0时，却更有利于胞外多糖的生成，其得率为2.34mg/ml，通过综合考虑，本实验认为猴头菌液体发酵的起始pH为5.5。
2.3 最佳裝液量的确定
菌丝体在发酵生长繁殖过程中，对氧气的需求比不可少，装液量的多少直接影响氧的溶解，装液量过大，摇瓶中空气空间有限，培养基中溶解的氧就少，对菌丝的生长、增殖不利;而装液量过小，在摇瓶培养中较难形成旋涡，这对菌球的形成不利，因此，必须通过实验确定合适的装液量。本实验针对摇瓶装液量设定了60ml、80ml、100ml、120ml、140ml这5个梯度进行培养研究3。
试验得出，摇瓶装液量的多少对菌丝体产量和胞外多糖得率的影响不一，无明显的变化规律。在250ml的三角瓶中，装液量为120ml时，菌丝体产量最高，为12.1mg/ml；但装液量为100ml时，胞外多糖得率最高，为2.54 mg/ml，通过综合考虑，本实验认为合适的装液量为100ml。
2.4 最佳接种量的确定
接种量的多少直接影响目标产物的产量、培养周期,接种量大可以加快菌丝体的生长，从而缩短培养期，但会导致菌丝体生长过旺、营养物质消耗过快，后期发酵后劲不足，最终影响产物的合成。本实验针对接种量设定了5ml、7.5ml、10ml、12.5ml、15ml这5个梯度进行培养研究。
试验得出，在1O0ml培养基中，接种量为7.5ml时对菌丝生长量和都比较高，菌丝体生物量为12.42mg/m1，胞外多糖为2.35 mg/m1，当接种量为10ml时，由于前期菌丝生长过于旺盛，培养基营养成分消耗迅速，不利于代谢产物多糖的生成，胞外多糖得率下降，随着接种量的进一步增加，菌丝体产量和胞外多糖都呈下降趋势，通过综合考虑，本实验认为最佳接种量为7.5ml。
2.5 最佳摇床转速的确定
摇床转速的大小决定了氧气在发酵液中的传递效果，转速较大时，通气量大，溶解氧增多，菌丝体生长量增多，菌球直径变小，胞外多糖产生量增加。但转速过快会导致菌丝缠绕过密，形成球、块状，反而不利于菌丝生长。本实验针对摇床转速设定了100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min这6个梯度进行培养研究。
试验得出，当转速为140r/nin、160r/min、180 r/min时，菌丝体生物量比较接近，但在转速为160r/min时，菌丝体生物量最大，为12.47mg/ml，胞外多糖得率在140r/min时达到最大，为2.45mg/ml。通过综合考虑，本实验认为最终转速选择为140r/min。
3 讨论
在确定最优发酵培养基的基础上，进行不同温度、起始pH、装液量、接种量、摇床转速的单因素试验，通过液体摇瓶培养，研究了各因素对菌丝体生物量和胞外多糖的影响。确定了猴头菌摇瓶培养的最优条件为：25℃、起始pH值5.5、摇瓶装液量100ml/250ml、接种量7.5ml、摇床转速14Or/min。
关注畜牧兽医联盟公众号：xmsylm 期待与您一起分享更多精彩内容！ 本联盟由《中国畜牧兽医文摘》、《兽医导刊》杂志等知名畜牧媒体联合主办 
|
